Součástí programu pro záchranu genetických zdrojů hospodářských zvířat České republiky je kryokonzervace genetického materiálu, která slouží jako zdroj genových rezerv. V současné době je v genobankách uchováván genetický materiál v podobě spermatu, embryí a oocytů. Sperma a embrya savců mohou být efektivně uchovávány v kryokonzervované formě v tekutém dusíku. Kryokonzervace oocytů, obzvlášť nezralých (ve fázi zárodečného váčku, GV – germinal vesicle), je oproti kryokonzervaci embryí náročná. Nízká životaschopnost rozmražených oocytů je způsobená především velikostí cytoplasmy. Buňky před kryokonzervací podléhají dehydrataci a nahrazení vody kryoprotektivy v mrazícím médiu. Čím větší buňka, tím je proces dehydratace a rehydratace při procesu kryokonzervace náročnější.

Izolace oocytů

Oocyty získané izolací z jatečných vaječníků, nebo po úhynu či utracení geneticky cenného zvířete jsou aspirovány spolu s folikulární tekutinou a granulózními buňkami z jednotlivých folikulů. Oocyty lze získat i z žijícího jedince pomocí metody OPU (ovum-pick up), kde se nasává folikulární tekutina z vaječníků jehlou připojenou na odsávací zařízení. Z folikulární tekutiny se poté izolují oocyty. Oocyty ve folikulech se nacházejí v nezralém stavu, ve stadiu zárodečného váčku. Aby nedocházelo k předčasnému dozrání oocytu, které počíná rozpadem membrány zárodečného váčku, je vhodné do manipulačního (M2 medium) i kultivačního media (M199, 0,2M Na pyruvát, 50 µg/ml gentamicin, 4 mg/ml BSA) přidat inhibitor fosfodiesterázy 3A, milrinone (2,5 µM), který brání oocytu předčasně pokračovat v meiotickém cyklu.

Příprava oocytů pro mikromanipulaci

Po hodině kultivace v inkubátoru při teplotě 38,5 °C s 6 % CO₂ v atmosféře se oocyty zbaví kumulárních buněk pomocí 0,1% roztoku hyaluronidázy v M2 médiu. Kumulární buňky obklopují oocyt a překážely by při následné mikromanipulaci. Pro lepší viditelnost jednotlivých struktur se oocyty skotu před izolací zárodečných váčků centrifugují (5500 rpm, 5 min, Eppendorf miniSpin), protože obsahují velké množství tukových granul v cytoplasmě. Tuková granula se nahromadí v jedné hemisféře cytoplasmy a zárodečný váček je tak lépe viditelný. S oocyty je mikromanipulováno v manipulačním mediu (M2) s 5 µg/ml cytochalasinu B a 3 µg/ml nocodazolu.

Izolace karyoplastů

Izolace karyoplastů je prováděna pomocí mikromanipulátoru.

Publikace je výsledkem řešení projektu v rámci podpory na rozvoj výzkumné organizace VÚŽV, v.v.i.: MZE RO0724, DKRVO V-01-01 s názvem „Vitrifikace zárodečných váčků živočišných druhů patřících do genetických zdrojů ČR.“

*

Článek byl odborně recenzován.

Mgr. Kristýna Vacková, Ing. Markéta Kohoutová, Ing. Treza Ranná, Ing. Josef Fulka, DrSc., VÚŽV, v. v. i.  Praha-Uhříněves Kontakt: vackova.kristyna@vuzv.cz